Новые статьи
Диагностика пероксисомных нарушений у детей
Диагностика пероксисомных нарушений у детей.И.С. Мамедов, Ю.А. Смолина, П.В. Новиков, В.С. Сухоруков
Резюме
В настоящей статье представлены данные об анализе длинноцепочечных жирных кислот, фитановой и пристановой кислот методом газовой хроматографии. Даны сведения о биохимических свойствах данных соединений и их биологической роли. Описана процедура анализа данных соединений методами газовой хроматографии от этапа пробоподготовки до получения конкретного результата. Представлены референсные значения уровней основных длинноцепочечных жирных кислот в плазме крови и динамика изменений этих значений при различной патологии, в частности, при наследственных болезнях пероксисом у детей.
Статья предназначена для врачей клинико-лабораторной диагностики и специалистов в области клинической генетики, детских неврологов.
Ключевые слова: полиненасыщенные жирные кислоты (ДЦЖК), газовая хроматография, клинико-лабораторная диагностика.
Внедрение достижений молекулярной генетики, иммунологии, аналитической биохимии, морфологии и других фундаментальных дисциплин привело к выделению целого класса новых заболеваний - так называемых «болезней клеточных органелл».
Благодаря изучению структуры и функций субклеточных образований при различной патологии человека стало возможным выделить болезни митохондрий, лизосомные болезни, пероксисомные болезни. Однако, если изучение первых двух классов заболеваний существенно прогрессирует, исследованию пероксисомных болезней уделяется недостаточное внимание [1].
Пероксисомы играют чрезвычайно важную роль в катаболизме полиаминов, процессах «пероксисомного дыхания», β-окислении очень длинноцепочечных (24-26 углеродных атомов и более) и дикарбоновых жирных кислот (С26 и более). Эти кислоты обычно поступают с пищей и, поскольку они не входят в состав человеческих липидов, подлежат разрушению. К ним относится, в частности, фитановая кислота, содержащаяся в растениях. Пероксисомное окисление очень длинноцепочечных жирных кислот с участием пероксисомного фермента ацил-КоА-оксидазы происходит в печени, жировой ткани, почках, кишечнике, легких, селезенке, надпочечниках. В пероксисомах наблюдается деградация некоторых ксенобиотиков, содержащих ацетальфосфатиды, и катаболизм простагландинов.
Важная роль принадлежит пероксисомам в процессах синтеза некоторых жизненно необходимых для организма соединений, например, плазмалогенов. Это фосфолипиды, в которых жирные кислоты объединены с глицерином не эфирной (енольной), а альгидной связью. Они составляют от 5 до 20% фосфолипидов клеточных мембран и необходимы для формирования нервной ткани. Плазмалогены защищают клетки от свободных радикалов кислорода. Пероксисомы участвуют в трансаминировании глиоксилатов, которые образуются из гликолата при участии пероксисомной оксидазы и могут в дальнейшем метаболизироваться до щавелевой кислоты. Наследственный дефицит фермента аланинглиоксилатаминотрансферазы в пероксисомах печени ведет к развитию гипероксалурии I типа, так как глиоксилат при этом преобразуется в щавелевую кислоту.
В связи с многообразием функций пероксисом становится очевидным, что нарушение одной или нескольких метаболических функций может стать причиной возникновения пероксисомных болезней [2]. Такие нарушения обычно приводят к накоплению в тканях и биологических жидкостях одного, нескольких или всех соответствующих метаболитов, в зависимости от количества функциональных нарушений. Эти накопления используются для (дифференциальной) биохимической диагностики пероксисомных нарушений, сопровождающихся отсутствием или дисфункцией пероксисом. Диагностика особенно важна при выявлении пероксисомных нарушений у детей, поскольку, например, при синдроме Цельвегера, если выявления на ранних стадиях не происходит, дети погибают спустя несколько месяцев после рождения от тяжелой гипотонии, нарушения питания, судорог, поражения печени и сердца [3].
Пероксисомы широко представлены в клетках всех тканей человека, за исключением эритроцитов. Они представляют собой круглые или овальные образования, диаметр которых колеблется от 0,2-1 мкм (в клетках печени и почек) до 0,1-0,2 мкм (в амниоцитах и фибробластах). В пероксисомах имеется около 40 типов ферментов, принимающих важнейшее участие в окислительном метаболизме клетки, обмене желчных кислот, жирных кислот, холестерина, процессах глюконеогенеза [4]. Пероксисомы играют важную роль в защите клеток от образующегося в их матриксе атомарного кислорода (результат разложения перекиси водорода) [5]. Доля пероксисомного поглощения кислорода составляет около 20% суммарного потребления кислорода в печени. Ферменты пероксисом используют кислород для окисления различных субстратов, продуцируя перекись водорода. Избыток перекиси водорода может быть опасен для клетки, однако, благодаря наличию в пероксисомах особого фермента - каталазы, быстро разлагающего перекись водорода, предупреждается повреждение клеток, а присутствие супероксиддисмутазы защищает клетку от другого токсического соединения кислорода - супероксиданиона.
Последние исследования показали, что пероксисомы, образующиеся из специального субдомена эндоплазматического ретикулума и, поэтому, не имеющие собственной ДНК, являются полуавтономными органеллами, которые способны расти и делится на дочерние пероксисомы. В настоящее время стало широко известно, что пероксисомы катализируют ряд важных метаболических функций, которые не могут быть осуществлены другими органеллами.
С точки зрения генетических заболеваний человека, особый интерес представляют следующие процессы: (1) бета-окисление жирных кислот, (2) биосинтез эфиросодержащих липидов, (3) альфа-окисление жирных кислот и (4) детоксикация глиоксилата.
Для выполнения этого набора функций, пероксисомы обладают уникальным набором ферментативных белков, катализирующих различные реакции. Кроме того, мембраны пероксисом имеют систему избирательного транспорта, дляпереноса субстратов из цитозоля внутрь органеллыи выведения конечных продуктов её метаболизма.
До настоящего времени не было единой классификации пероксисомных болезней. Это объясняется как малой изученностью функций пероксисом, так и отсутствием единого критерия, который можно было бы положить в основу классификации. Попытки использовать для обоснования классификации морфологический критерий (отсутствие или наличие пероксисом в клетках) оказались безуспешными.
В последние годы ведутся исследования, направленные на применение в качестве основополагающих критериев пероксисомных болезней первичных биохимических и генных дефектов.
К настоящему времени в основу разделения пероксисомных болезней положены два критерия - морфологический (отсутствие или наличие пероксисом в печени) и биохимический (нарушение одной или нескольких функций пероксисом), которые необходимо оценивать в каждом случае одновременно. Это позволяет выделить три группы пероксисомных болезней:
1-я группа - болезни, связанные с генерализованным нарушением биологических функций пероксисом и отсутствием или значительным уменьшением количества пероксисом в печени. К этому классу относятся синдром Целльвегера (СЦ), инфантильная форма болезни Рефсума, неонатальная адренолейкодистрофия, точечная остехондродисплазия, ряд форм амавроза Лебера, гиперпипеколловая ацидемия, ризомелическая точечная хондродисплазия (РТОХД) первого типа и др. Для этих заболеваний характерно полное нарушение биогенеза пероксисом, но в различной степени. При РТОХД первого типа, биогенез пероксисом нарушен лишь частично, а при синдроме Целльвегера в основном нарушены все пероксисомные функции, что приводит к накоплению целого ряда пероксисомных метаболитов в плазме, тогда как при РТОХД первого типа затронуты только биосинтез эфиросодержащих липидов и альфа-окисление фитановой кислоты.
2-я группа - заболевания, обусловленные нарушением нескольких биологических функций пероксисом при нормальном количестве пероксисом в печени. К ним относятся целльвегероподобный синдром, синдром недостаточности бифункционального белка [6], синдром псевдоцелльвегера и др.
3-я группа - включает болезни, при которых нарушена одна биологическая функция пероксисом и имеется нормальное содержание пероксисом в печени. Эта группа также подразделяются на различные подгруппы, в том числе, нарушения пероксисомного бета-окисления - X-сцепленная адренолейкодистрофия (X-АЛД), недостаточности ацил-КoA-оксидазы 1 [7], недостаточности 2-метил-ацил-КоА-редуктазы (МАКoАР) [8] недостаточности белка, транспортирующего стирол (СТБ) [9],нарушения биосинтеза эфиросодержащих липидов (недостаточности дигидроксиацетона фосфат ацилтрансферазы и алкил-дигидроксиацетона фосфат-синтазы) [10], нарушения альфа-окисления фитановой кислоты (болезнь Рефсума, взрослый тип) [11], а также, в качестве единственного представителя, нарушение детоксикации глиоксилата с гипероксалурией первого типа, вызванное недостатком аланин глиоксилат аминотрансферазы.
В таблице 1 приведены различные пероксисомные нарушения и уровни длинноцепочечных пристановой и фитановой кислот для каждого из этих нарушений. Данные свидетельствуют о том, что содержание длинноцепочечных жирных кислот (ДЦЖК) повышено при спектре нарушений Целльвегера (СНЦ), а также при X-АЛД, дефиците ацил-СоА оксидазы, и недостаточности D-бифункциональных белков, но в норме в случае других нарушений, в том числе при дефиците СТБ, и дефиците МАКoАР. Однако, в случае двух последних нарушений накапливается пристановая кислота, а также желчные кислоты являются интермедиатами ди- и тригидроксихолестановых кислот. Уровень пристановой кислоты повышается при СНЦ, при РТОХД первого типа, а также при болезни Рефсума. Таким образом, совместный анализ ДЦЖК, пристановой и фитановой кислот является действенным методом для выявления больных с пероксисомными нарушениями, хотя нарушения биосинтеза эфиросодержащих липидов, в частности при РТОХД 2-ого и 3-его типов, а также гипероксалурия первого типа требует проверки содержания других метаболитов, в том числе уровня плазмалогенов в эритроцитах и уровни глиоксилата, гликолата и оксалата в моче, соответственно.
Таблица 1. Уровни содержания длинноцепочечных жирных кислот, пристановой и фитановой кислот при различных пероксисомных нарушениях.
| Группа 1 | ДЦЖК | Пристановая к-та | Фитановая к-та |
| Спектр нарушений Цельвегера (СНЦ) | ↑ | N-↑* | N-↑* |
| Ризомелическая точечная хондродисплазия (РТОХД) первого типа | N | ↓-N | N-↑* |
| Группа 2 | |||
| Пероксисомные нарушения бета-окисления | |||
| X-сцепленная адренолейкодистрофия | ↑ | N | N |
| Недостаточность ацил-CoA-оксидазы | ↑ | N | N |
| Недостаточность D-бифункциональных белков | ↑ | N-↑* | N-↑* |
| Недостаточность белка, транспортирующего стирол (СТБ) | N | N-↑* | N-↑* |
| Недостаточность 2-метил-ацил-CоА-редуктазы (МАCoАР) | N | N-↑* | N-↑* |
| Нарушения биосинтеза эфиросодержащих липидов | |||
| РТОХД второго типа | N | N | N |
| РТОХД третьего типа | N | N | N |
| Нарушения альфа-окисления фитановой кислоты | |||
| Болезнь Рефсума | N | N | N-↑* |
| Нарушение детоксикации глиоксилата | |||
| Гипероксалурия первого типа | N | N | N |
↑ - повышенный уровень
* - уровень содержания может варьироваться от нормального до повышенного в зависимости от питания и возраста
Свойства исследуемых веществ
ДЦЖК, также как и жирные кислоты с разветвленной цепью: пристановая и фитановая кислоты, чрезвычайно гидрофобны и практически нерастворимы в воде. Внутри клетки они находятся в форме эфиров кофермента A. Эти кислоты, как правило, содержатся в липидосодержащих тканях, таких, как жировая ткань, но также, они могут быть составляющими различных физиологически важных липидов, таких как миелин. В связи с этим, ДЦЖК и жирные кислоты с разветвленным строением в изобилии присутствуют во многих тканях и органах.
ДЦЖК с циклическим и разветвленным строением существуют в форме эфиров таких, как триглицериды, фосфолипиды, эфиры холестерина, и даже в форме карнитиновых эфиров. В свободной форме ДЦЖК трудно поддаются обнаружению, поскольку, связываются с белками плазмы, такими, как альбумин. Следовательно, ДЦЖК не фильтруется почками и не должны присутствовать в моче.
Насыщенные ДЦЖК и жирные кислоты с разветвленным строением являются стабильными соединениями, они не разрушаются в присутствии окислителей. В связи с этим, для хранения образцов достаточно их заморозить.
Хотя у пациентов с нарушенными пероксисомными функциями будет наблюдаться повышенное содержание ДЦЖК с цепью длиной свыше 26 углеродных атомов [12], в процессе диагностики можно также использовать жирные кислоты C22, C24, C26 и их соотношения [13].
Основы метода
Для анализа отбирается от 2-х до 5 мл венозной крови как у детей, так и взрослых пациентов. В качестве антикоагулянта предпочтительно используется ЭДТА, центрифугирование в течение 10 минут, далее плазма собирается аспирацией и храниться при – 20 ˚С. По возможности, забор образцов крови следует делать до завтрака, непосредственно после сна. Однако, поскольку, уровень содержания ДЦЖК показывает только минимальные суточные изменения, также пригодны образцы, взятые и в послеобеденное время. Важно отметить, что, поскольку, содержание ДЦЖК, фитановой и пристановой кислот не изменяется при хранении проб при комнатной температуре в течение нескольких дней, образцы могут транспортироваться в этих условиях, хотя мы рекомендуем их заморозить, особенно, если сроки перевозки превышают 48 ч. Уровень содержания исследуемых соединений в замороженной плазме сохраняется неизменным в течение 2 лет.
В нашей работе применяется метод газовой хроматографии с масс-детектированием (ГХ-МС) и ионизацией электронным ударом на анализаторах (Agilent 6850/5375, ShimadzuGS 17A/GSMS-QP 5050 Российский Государственный Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова (РГМУ), кафедра клинической лабораторной диагностики). Метод предусматривает предварительную дериватизацию N-метил-N-(трет-бутилдиметилсилил)трифлюороацет-амидом (MTBSTFA) в сочетании с использованием стабильных изотопов для жирных кислот C26:0, C24:0, C22:0, пристановой и фитановой кислот [14]. Для того чтобы определить общее содержание ДЦЖК, пристановой и фитановой кислот, образцы необходимо подвергнуть кислотному и щелочному гидролизам с последующей экстракцией гексаном.
Большое число образцов плазмы, отобранных у различных пациентов, которые поступают в лабораторию из различных клинических баз РГМУ, были объединены и тщательно перемешаны. Из общей смеси в эппендорфы отбирают аликвоты по 150 мкл и хранят их при - 20 ° C. Для каждой серии анализа используются образцы, полученные из смеси плазмы одной выборки (пула).
Нормы и патологические значения
ДЦЖК синтезируются в пероксисомах. Эти клеточные органеллы не проявляют заметных изменений активности белка в течение дня или с возрастом. В связи с этим, эталонные значения могут быть определены довольно точно.
Эталонные (справочные) значения для неразветвлённых жирных кислот, используемые в нашей работе, были получены на основании анализа 157 контрольных образцов (таблица 2) и литературных данных [11]. Концентрация ДЦЖК в контрольных образцах не зависит от возраста. Пристановая и фитановая кислоты - или их прекурсор фитол - попадают в организм исключительно из продуктов питания. В связи с этим, эталонные значения для этих веществ, в определенной степени, зависят от возраста, особенно до 2 лет [15]. Верхний эталонный уровень для фитановой кислоты составляет 10 мкмоль/л, тогда как для пристановой кислоты 3 мкмоль/л для людей в возрасте от 2-х лет и более.
Таблица 2. Концентрации ДЦЖК в плазме контрольных образцов. Все концентрации приведены в мкмоль/л
| Определяемые соединения | Среднее значение | 5-95% доверительный интервал |
| С22:0 | 75 | 40-119 |
| С24:0 | 56 | 33-84 |
| С26:0 | 0,79 | 0,45-1,32 |
| C24/С22 | 0,75 | 0,57-0,92 |
| C26/С22 | 0,01 | 0,01-0,02 |
Что касается патологических значений, наиболее информативной является жирная кислота C26:0. У большинства пациентов с синдромом Цельвегера уровень содержания жирной кислоты C26:0 равен 3-12 мкмоль/л, что превышает эталонные значения в 3 -10 раз. Для сравнения, у мужчин с заболеванием Х-сцепленной адренолейкодистрофии и адреномиелоневропатии уровень содержания С26:0 в основном 2-4 мкмоль/л. Ложноотрицательные результаты для мужчин с этими заболеваниями чрезвычайно редки, в отличии от уровня содержания С26:0 у женщин больных Х-сцепленной адренолейкодистрофией, который варьируется от 1,1 до 2,9 мкмоль/л и, таким образом, совпадает с нормальным. В случае жирной кислоты С24:0 ситуация слегка отличается: наблюдается значительное перекрывание между уровнями содержания этой кислоты у больных и нормальным уровнем контрольного образца. Однако, отношение С24:С22, значение которого для контрольного образца < 0,92 является избыточным практически для всех пациентов и равно 1,06, но у женщин с Х-АЛД значение соотношения C24:C22 может быть равным вплоть до 0,8. Одного анализа ДЦЖК не достаточно для того, чтобы полностью исключить Х-АЛД; точный результат теста на это заболевание может быть получен только в случае, если этот анализ сопровождается анализом ДНК.
У пациентов с наследственными нарушениями пероксисомальной функции наблюдается повышенный уровень содержания как жирной кислоты С26:0, так и соотношения C24:C22. Увеличение только уровня содержания С26:0 редко приводит к правильной диагностике. Тем не менее, постоянные отклонения уровня ДЦЖК и/или их соотношения следует проверять при изучении фибробластов, для того, чтобы правильно диагностировать и рекомендовать генетическое обследование семьи. Ложноположительный уровень ДЦЖК встречается редко; единственным хорошо известным примером является кетогенная диета (диета с высоким содержанием жира и низким количеством углеводов), следовательно, для верного заключения и постановки диагноза необходимо учитывать результаты анализа содержания одновременно фитановой и пристановой кислот. Как правило, у пациентов с нарушением биогенеза пероксисом или нарушениями в системе пероксисомного β-окисления наблюдается повышенный уровень обеих жирных кислот с разветвленным строением в различных соотношениях. Исключения, естественно, составляют пациенты с АЛД/АМН или дефицитом ацил-КоА-оксидазы, имеющие нормальный уровень разветвленных жирных кислот.
Пациенты с болезнью Ревсума могут иметь крайне высокий уровень фитановой кислоты, до 1500 мкмоль/л, и при этом очень низкий уровень пристановой кислоты (<1 мкмоль/л) вследствие дефицита фитаноил-КоА-гидролазы. Менее выраженное повышение уровня фитановой кислоты наблюдется у пациентов, больных ризомелической точечной хондродисплазией первого типа и наблюдается как в форме классической болезни, так и в различных ее вариациях. Значения могут меняться от 200 до 900 мкмоль/л, в некоторой степени зависят от возраста. В настоящее время обсуждаются случаи появления избытка фитановой кислоты при классической ризомелической точечной хондродисплазии у новорожденных. В лаборатории авторов [13], занимающихся этими случаями, было установлено значение нормальное уровня фитановой кислоты в плазме пациентов возрастом младше одной недели (0,7-5,8 мкмоль/л). Пациенты в возрасте от двух до трех недель имеют увеличенный уровень фитановой кислоты 9,1-13,2 мкмоль/л. Как правило, у пациентов в любом возрасте невозможно определить уровень плазмогена эритроцитов. В некоторых случаях наблюдается небольшое увеличение уровня фитановой кислоты до значения 15-35 мкмоль/л. Несмотря на детальное изучение фибробластов у нескольких пациентов, объяснения этому явлению до сих пор не было найдено.
Тот факт, что уровень фитановой кислоты зависит от питания, позволяет уменьшить накопление фитановой кислоты за счет диеты. Пациенты с болезнью Рефсума могут достичь практически нормального уровня фитановой кислоты в плазме с помощью строгой диеты, сопровождающейся плазмоферезом, если это необходимо.
К сожалению, небольшое число пациентов с пероксисомной дисфункцией не могут быть диагностированы с использованием только анализа плазмы. Авторами некоторых статей были описаны случаи нарушения биогенеза пероксисом, дефицитом D-бифункциональных белков и ацил-CoА-оксидазы у пациентов, анализ плазмы которых не выявил отклонений уровня ДЦЖК, фитановой, пристановой или желчных кислот. Очевидно, подозрение на пероксисомные нарушения всегда следует подтверждать исследованием фибробластов вне зависимости от результатов анализа плазмы.
Списоклитературы:
1. Вальтищев Ю.Е. Клиническая генетика и практическая педиатрия. Российский вестник перинатологии и педиатрии 1995; (3): 8-14
2. Wanders R.J.A., van Roermund C.W.T., Schutgens R. The inborn errors or peroxisomal-beta-oxydation: a review. J Inherit Metab Dis 1990; 13 (2): 4 – 36.
3. Руководство по педиатрии / [под ред. А.А.Баранова, Б.С.Каганова, Р.Р.Шиляева]. – Т: Врождённые и наследственные заболевания / [под ред. П.В. Новикова]. – М.: Издательский Дом «Династия», 2007. – 544 с.
4. Hajara A.K., Bishop J.E. Glycerolipid biosyntesis in peroxisomes via the acyl-dihydroxyaceton phosphate pathway. Ann N.Y. Sci 1992; 386 (1): 170.
5. Del Rio L.A., Sandalio L.M., Palma J.M. A new cellular function for peroxisoms related to oxygen free radicals. Experientia 1990; 46 (1): 986–92.
6. Ferdinandusse S, Denis S, Mooyer PA, Dekker C, Duran M, Soorani-Lunsing RJ, Boltshauser E, Macaya A, Gartner J, Majoie CB, Barth PG, Wanders RJ, Poll-The BT Clinical and biochemical spectrum of D-bifunctional protein deficiency. Ann Neurol 2006; 59:92 –104.
7. Ferdinandusse S, Denis S, Hogenhout EM, Koster J, van Roermund CWT, IJlst L, Moser AB, Wanders RJA, Waterham HR Clinical, biochemical, and mutational spectrum of peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase deficiency. Hum Mutat 2007; 28: 904–912.
8. Ferdinandusse S, Denis S, Clayton PT, Graham A, Rees JE, Allen JT, Mclean BN, Brown AY, Vreken P, Waterham HR, Wanders RJA Mutations in the gene encoding peroxisomal alpha-methylacyl-CoA racemase cause adult-onset sensory motor neuropathy. Nat Genet 2000; 24: 188–191.
9. Ferdinandusse S, Kostopoulos P, Denis S, Rusch H, Overmars H, Dillmann U, Reith W, Haas D, Wanders RJA, Duran M, Marziniak M Mutations in the gene encoding peroxisomal 3.4 Very-Long-Chain Fatty Acids 230 and Phytanic Acid sterol carrier protein X (SCPx) cause leukencephalopathy with dystonia and motor neuropathy. Am J Hum Genet 2006; 78:1046–1052.
10. Clayton PT, Eckhardt S, Wilson J, Hall CM, Yousuf Y, Wanders RJA, Schutgens RBH Isolated dihydroxyacetonephosphate acyltransferase deficiency presenting with developmental delay. J Inherit Metab Dis 1994; 17:533–540.
11. Wanders R.J.A, Jakobs C, and Skjeldal O.H Refsum disease. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds) The Metabolic & Molecular Bases of Inherited Disease. McGraw-Hill, New York2001; 3303-3321.
12. Kemp S, Valianpour F, Denis S, Ofman R, Sanders RJ, Mooyer P, Barth PG, Wanders RJ Elongation of very long-chain fatty acids is enhanced in X -linked adrenoleukodystrophy. Mol Genet Metab 2005; 84:144–151.
13. Moser AB, Kreiter N, Bezman L, Lu S, Raymond GV, Naidu S, Moser HW Plasma very long chain fatty acids in 3,000 peroxisome disease patients and 29,000 controls. Ann Neurol 1999; 45:100–110.
14. Vreken P, Van Lint AEM, Bootsma AH, Overmars H, Wanders RJA, Van Gennip AH Rapid stable isotope dilution analysis of very-long-chain fatty acids, pristanic acid and phytanic acid using gas chromatography-electron impact mass spectrometry. J Chromatogr 1998; 713:281–287.
15. ten Brink HJ, Stellaard F, van den Heuvel CM, Kok RM, Schor DS, Wanders RJA, Jakobs C Pristanic acid and phytanic acid in plasma from patients with peroxisomal disorders: stable isotope dilution analysis with electron capture negative ion mass fragmentography. J Lipid Res 1992; 33: 1–47.
