Новые статьи
Хроматографический метод определения катехоламинов
НОВЫЙ МЕТОД ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА МЕТАБОЛИТОВ КАТЕХОЛАМИНОВ И СЕРОТОНИНА В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РАЗЛИЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ1Ю.А. Смолина, 1И.В. Золкина, 2П.Б. Глаговский, 1И.С. Мамедов, 1В.С. Сухоруков
1Федеральное государственное учреждение «Московский научно–исследовательский институт педиатрии и детской хирургии» министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации, научно–исследовательская лаборатория общей патологии (заведующий НИЛ общей патологии «МНИИ педиатрии и детской хирургии», доктор медицинских наук, профессор В.С. Сухоруков), 2Российский Государственный Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова, кафедра клинической лабораторной диагностики ФУВ (заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики проф. д.б.н. Шербо С.Н.).
Резюме. В настоящей статье представлен новый высокотехнологичный метод определения метаболитов катехоламинов и серотонина в моче и плазме крови. Рассмотрены эффекты данных веществ и значение их основных метаболитов в норме и при различных патологических состояниях, показана эффективность применения данной методики в лабораторной диагностике ряда заболеваний.
Статья предназначена для врачей-педиатров, эндокринологов, наркологов и психиатров, специалистов клинической лабораторной диагностики.
Ключевые слова: метаболиты катехоламинов, серотонин, диагностика.
Новый метод хроматографического анализа метаболитов катехоламинов и серотонина в лабораторной диагностике различных заболеваний. 1Ю.А. Смолина, 1И.В. Золкина, 2П.Б. Глаговский, 1И.С. Мамедов, 1В.С. Сухоруков. 1НИЛ общей патологии ФГУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии»,2кафедра клинической лабораторной диагностики ФУВ РГМУ.
Summary: In the present review a new high-tech method for determining metabolites of catecholamines and serotonin in urine and serum is set out. The effects of these substances and the value of their main metabolites in normal and various pathological conditions are considered, the efficiency of application of this technique in the laboratory diagnostic of several diseases are shown.
Article is intended for pediatricians, endocrinologists, narcologists and psychiatrists, specialists of clinical laboratory diagnostics.
Keywords: metabolites of catecholamines, serotonin, diagnostics.
Введение.
Катехоламины – группа ароматических аминов, включающая адреналин (эпинефрин), норадреналин (норэпинефрин) и дофамин, которые действуют и как гормоны, и как нейротрансмиттеры. Они синтезируются в мозговом веществе надпочечников, симпатической нервной системе и в мозге. Адреналин и норадреналин образуются из дофамина и действуют на сердечную мускулатуру, помогая организму справляться со стрессом [1]. Так как при многих заболеваниях катехоламины и их метаболиты секретируются в большом количестве, эти вещества удобно использовать для диагностических целей. Значительное повышение уровня катехоламинов обнаруживается при таких опухолях, как феохромацитома, нейробластома, ганглионеврома, поскольку они являются катехоламин–продуцирующими [2, 3]. Уровень катехоламинов существенно изменяется при гипертензии, кардиопатиях, шизофрении и маниакально–депрессивных расстройствах [4, 5]. Вопросом о роли катехоламинов в организме с точки зрения острого и хронического стресса занимается спортивная медицина [6].
Определение адреналина и норадреналина в клинической практике необходимо главным образом для диагностики феохромацитомы и дифференциальной диагностики гипертензий [4, 7]. Приблизительно один из двухсот пациентов с повышенным артериальным давлением страдает от феохромацитомы – опухоли хромаффинной ткани надпочечников, в которой в норме происходит выработка катехоламинов. У этих больных концентрация катехоламинов в крови увеличивается в 10 – 100 раз [7]. Большинство феохромацитом секретируют в кровь в первую очередь норадреналин и в меньшей степени адреналин. При гипертонической болезни уровень катехоламинов в крови находится на верхней границе нормы или увеличен в 1,5 – 2 раза [4]. При стрессе отмечается десятикратное повышение содержания адреналина в плазме. Однако в крови отмечается быстрая элиминация катехоламинов из кровотока, поэтому в целях диагностики целесообразно определять их в моче.
Исследование уровня катехоламинов в крови и их экскреция с мочой важны не только для диагностики феохромацитомы, но и для контроля за эффективностью лечения. Радикальное удаление опухоли сопровождается нормализацией экскреции этих веществ, а рецидив опухоли приводит к повторному увеличению экскреции катехоламинов. Раздельное определение адреналина и норадреналина в моче позволяет получить ориентировочные данные о возможной локализации опухоли. Если опухоль происходит из мозгового вещества надпочечников, то более 20% выделяемых с мочой катехоламинов будет составлять адреналин. При преимущественной экскреции норадреналина возможна вненадпочечниковая локализация опухоли, наиболее часто речь идет о нейробластоме. Определение степени «созревания» опухоли по результатам соотношения катехоламинов и их метаболитов в моче имеет большое клиническое значение [7].
Снижение концентрации катехоламинов в моче отмечается при снижении фильтрационной способности почек, коллагенозах, острых лейкозах (особенно у детей) [8].
Определение дофамина и метаболитов адреналина и норадреналина имеет особое значение для подтверждения диагноза нейробластомы у детей. Нейробластома – опухолевое заболевание младенцев, детей раннего возраста и, стоящее на третьем месте по встречаемости среди раковых заболеваний (7–11%), детей старшего возраста [9]. В последнее время прилагается много усилий для диагностики нейробластомы на ранней стадии развития. Биологическая природа нейробластомы позволяет проводить легкую диагностику данного заболевания в раннем детстве. Из-за взаимодействия клеток опухоли и симпатической нервной системы, происходит повышенная экскреция катехоламинов, а, следовательно, у пациентов происходит усиленное выделение с мочой основных метаболитов катехоламинов – ГВК и ВМК, что используется как скрининговое исследование на нейробластому [9]. Ранее ряд исследователей показали значимость определения соотношения ВМК/ГВК на ранних стадиях развития нейробластомы и рекомендовали его для массового скрининга. Среди всех обследованных, которым удалось выявить нейробластому на ранних этапах, выживаемость составила 97%, в отличие от 45% детей, которым диагноз был поставлен клинически.
Общие метанефрины представляют собой промежуточные продукты метаболизма адреналина. 55% продуктов метаболизма адреналина выводится с мочой в форме метанефрина [1]. Значительное повышение содержания метанефринов в моче выявляют у больных с феохромацитомой, нейробластомой (у детей), ганглионевромой [7,9]. Исследование назначается совместно с определением адреналина и норадреналина для того, чтобы повысить вероятность диагностики перечисленных заболеваний. Общие норметанефрины являются промежуточными продуктами метаболизма норадреналина. Их определяют с целью диагностики феохромацитомы [7]. В отличие от других продуктов метаболизма катехоламинов, на содержание норметанефринов в моче не оказывают влияние антигипертензивные препараты. Чувствительность определения метанефринов и норметанефринов для диагностики феохромацитомы составляет 67–91%, специфичность 100%. Достоверность диагностики феохромацитомы повышается, если мочу для исследования собирать после эпизода повышения артериального давления [7].
Серотонин – биогенный амин, содержащийся главным образом в тромбоцитах. 80–95% его синтезируется энтерохромаффинными клетками желудочно-кишечного тракта. Большая часть серотонина адсорбируется тромбоцитами и поступает в кровеносное русло. Серотонин вызывает агрегацию тромбоцитов и полимеризацию молекул фибрина. Он оказывает стимулирующее действие на гладкую мускулатуру сосудов, бронхиол, кишечника [1]. Недостаток серотонина лежит в основе функциональной кишечной непроходимости. В клинической практике определение серотонина в крови особенно информативно при карциноидах желудка, кишечника или легких, когда его концентрация повышается в 5–10 раз [10]. После радикального оперативного удаления карциноида уровень серотонина в крови нормализуется. Отсутствие нормализации уровня серотонина свидетельствует о нерадикальности операции или наличии метастазов [10].
Определение повышенных уровней основного конечного метаболита серотонина – 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в моче подтверждает наличие карциноида – гормонально-активной опухоли. Он развивается из энтерохромаффинных клеток и локализуется преимущественно в желудочно–кишечном тракте (обычно в дистальном отделе подвздошной кишки), но может встречаться и в других органах – бронхах, поджелудочной железе, яичниках. Нефункционирующий карциноид, как правило, протекает бессимптомно. Вырабатываемые опухолью серотонин и брадикинин метаболизируются в печени [10,11]. При функционирующем карциноиде (наличии метастазов в других органах, из которых кровь оттекает минуя печень) развивается карциноидный синдром, характеризующийся кратковременными приливами крови к лицу и верхней половине туловища, диареей, развитием эндокардиального фиброза и др. В типичных случаях диагностика карциноидного синдрома не вызывает затруднений, но иногда при тяжелой гипертонии и маловыраженных других симптомах его принимают за гипертонический криз. Приступы, подобные таковым при карциноидном синдроме, наблюдаются при мастоцитозе, а также у женщин в климактерическом периоде и при некоторых опухолях, например, раке щитовидной железы. Умеренное повышение выделения 5–ГИУК помимо карциноидного синдрома встречается при глютеновой энтеропатии, острой тонкокишечной непроходимости [11].
Ещё одним перспективным приложением тонкого хроматографического анализа метаболитов катехоламинов и серотонина является оценка вегетативного статуса у детей. Исследования последних лет показали, что исходный вегетативный тонус в сердечно-сосудистой системе детей сопряжен с экскрецией катехоламинов и метаболитов глюкокортикоидов. Установлено, что с возрастом и по мере полового созревания детей 7–15 лет наблюдается синхронизм в проявлении функциональной активности симпатоадреналовой системы и коры надпочечников [12].
Таким образом, катехоламины, серотонин и их метаболиты являются достаточно чувствительными и специфичными диагностическими биохимическими маркёрами различных заболеваний (в то числе, и в детском возрасте). Поэтому разработка новых методов их анализа является важной как для фундаментальной медицины, так и для практической.
В настоящее время известны ряд методик определения данных метаболитов, а именно иммуноферментный анализ, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [13] и газовая хроматография – масс-спетрометрия (ГХ–МС) [14]. Диагностика различных заболеваний по изменению метаболизма катехоламинов и серотонина должна быть очень чувствительной. Для выявления таких изменений различные иммуноферментные методы не подходят, так как они являются недостаточно информативными. Поэтому для выявления изменений концентраций метаболитов катехоламинов и серотонина нужны более точные чувствительные методы их определения, такие как ВЭЖХ и ГХ–МС.
Материалы и методы.
В ходе проведения исследования образцами для анализа служила суточная моча пациентов с диагностируемым заболеванием. После сбора суточной мочи от общего объёма в пластиковый контейнер отбиралось около 100 мл биоматериала, на этикетке указывался диурез.
В качестве консерванта использовалась 6 н. соляная кислота. После подкисления срок хранения проб в холодильнике при температуре +2 – +8 °С не превышает 5 дней, поэтому для длительного хранения образцы замораживали при –20 °С.
Отобранный биоматериал подвергался количественному анализу методами газовой и высокоэффективной хроматографии.
Метод газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектором (ГХ–МС, GC–MS).
Процесс пробоподготовки включал в себя селективную жидкостную экстракцию конечных метаболитов катехоламинов и серотонина, концентрирование экстрагента и дериватизацию при 80 °С. В качестве внутреннего стандарта использовался метилтестостерон.
Определение метаболитов адреналина, норадреналина, серотонина и дофамина – гомованилиновой кислоты (HVA), ванилинминдальной кислоты (VMA) и 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA) проводили на газовом хроматографе с масс-спектрометрическим детектором фирмы ShimadzuGCMSQP–5050A, оснащённым автоинжектором AOC–20i (Российский Государственный Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова, кафедра клинической лабораторной диагностики).
Для каждого образца были получены хроматограммы, по которым с помощью компьютерной системы обработки данных CLASS-VPTM ChromatographyDataSystemдля газового хромато-масс-спектрометра определялись концентрации соответствующего метаболита в мг/сут. Все данные подвергались статистической обработке. Типичная масс–спектрограмма приведена на рисунке 1.
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, HPLC).
При проведении анализа в качестве стандартов использовались гомованилиновая, ванилинминдальная, 5-гидроксииндолуксусная кислоты. В качестве внутреннего стандарта – изо-ванилинминдальная кислота. Все соединения были приобретены у компании Sigma-Aldrish. Стандартные растворы веществ (100 мг/л) были приготовлены разбавлением в соляной кислоте (10 ммоль/л, производство Россия, Химмед) и хранились при температуре 4 оС. В таком состоянии они стабильны 6 месяцев. Рабочие растворы готовились разбавлением стандартного в 10 раз.
Анализ проб производился с помощью жидкостного тандемного хромато-масс-спектрометра Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS с автосэмплером, состоящего из двойного градиентного насоса серии Agilent 1200, вакуумного дегазатора, аналитической колонки Zorbax Eclipse XDB8–C18 (4.0х150 мм; размер частиц 5 мкм), оснащённой контроллером температуры.
Полученные данные анализировались с помощью программного обеспечения ChromSystem для анализа и идентификации хроматографических пиков. Типичная хроматограмма показана на рис. 2. В конечном итоге, вычисляется концентрация определённого метаболита в моче в виде мг/сут.
Результаты и обсуждение.
Благодаря совместным исследованиям НИЛ общей патологии МНИИ педиатрии и детской хирургии с кафедрой клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО РГМУ в настоящее время возможно проведение одновременного определения метаболитов катехоламинов и серотонина – гомованилиновой, ванилинминдальной и 5-гидросииндолуксусной кислот с помощью метода газовой хроматографии масс-спектрометрии. Использование разработанной методики позволяет сократить время анализа и позволяет анализировать до 100 образцов в день. Таким образом, можно использовать данный метод для проведения скрининговых исследований на наличие нейробластомы, феохромацитомы, карциноидного синдрома и других заболеваний, при этом заметно облегчая современный диагностический поиск практикующим врачам.
В ходе исследования проведен хроматографический анализ метаболитов катехоламинов и серотонина описанными методиками примерно у 100 детей с подозрением на различные заболевания. На основании анализа мочи и плазмы крови пациентов были определены референсные значения катехоламинов, серотонина и их основных метаболитов (табл. 1 и 2). У 3 детей был подтвержден диагноз нейробластомы (показатели ВМК ГВК, полученные методами ГХ–МС и ВЭЖХ, были выше возрастной нормы в среднем в 3 раза), у 5 детей был подтверждён диагноз феохромоцитомы, причём у 3 детей она была диагностирована на ранних стадиях в субклинической фазе.
Таким образом, сочетание методов ГХ–МС и ВЭЖХ-МС для анализа метаболитов катехоламинов и серотонина показало свою эффективность как метод диагностики и может быть рекомендовано в качестве скринирующей методики для раннего выявления ряда опухолевых заболеваний у детей в нашей стране. Методы, описанные в данной статье, являются высокочувствительными, специфичными, быстрыми и не сильно дорогостоящими, что позволяет их применять в медицинской практике медицинских учреждений.
Выводы.
- Отработаны количественные методики совместного определения основных метаболитов катехоламинов и серотонина в моче и плазме крови.
- Проведено сравнительное изучение хроматографических методов анализа исследуемых соединений. Выявлено, что наиболее точной подтверждающей методикой определения основных метаболитов катехоламинов и серотонина является сочетание методов газовой хроматографии-масс-спектрометрии и ВЭЖХ.
- Показана возможность использования в клинико-лабораторной практике уровней основных метаболитов катехоламинов (гомованилиновой, ванилинминдалевой и 5-гидроксииндолуксусной кислот) в моче и плазме крови и их изменений в качестве диагностических маркёров злокачественных опухолей: феохромоцитома, нейробластома, карцинома.
| Показатель | Значение, нмоль/сут | Значение, мкг/сут |
| Норадреналин | До 570 | До 97 |
| Адреналин | До 150 | До 27 |
| Дофамин | До 3240 | До 500 |
| ВМК (VMA) | До 33,0 | До 6,6 |
| ГВК (HVA) | До 38,0 | До 6,9 |
| 5–ОИУК (5–HIAA) | 10,5 – 47,1 | 2,0 – 9,0 |
Литература.
1. Физиология человека Compendium / под редакцией академика РАМН Б. И. Ткаченко и проф. В. Ф. Пятина. – 2-е издание исправленное и переработанное. – Самарский дом печати, 2002. – C.416.2. Kushner B.H. Neuroblastoma: a disease requiring a multitude of imaging studies // J. Nucl. Med. – 2004. – Vol.45. – P.1172–1188.
3. Reisch N., Peczkowska M., Januszewicz A., Neumann H.P. Pheochromocytoma: presentation, diagnosis and treatment // J. of hypertension. – 2006. – Vol.24. – P.2331–2339.
4. Kjeldsen S.E., Neubig R.R., Weder A.B., Zweifler A.J. The hypertension-coronary heart disease dilemma: the catecholamine blood platelet connection // J. Hypertens. – 1989. – Vol.7. – P.851–860.
5. Zumárraga M., Dávila R., Basterreche N. et al. Catechol O-methyltransferase and monoamine oxidase A genotypes, and plasma catecholamine metabolites in bipolar and schizophrenic patients // Neurochem. Int. – 2010. – Vol.56(6–7). – P.774–779.
6. Litschka–Schimpf G., Manzl G., Schimpf A. et al. Influence of different experimental recreation treatments on sympathoadrenergic and metabolic regulation mechanisms in repeated exercises // Int. J. Sports. Med. – 1988. – Vol.9. – Suppl. 2. – P.146–150.
7. Barron J. Phaeochromocytoma: diagnostic challenges for biochemical screening and diagnosis // J. Clin. Pathol. – 2010. – Vol.63(8). – P.669–674.
8. Silverstein F.S., Hutchinson R.J., Johnston M.V. Cerebrospinal fluid biogenic amine metabolites in children during treatment for acute lymphocytic leukemia // Pediatr. Res. – 1986. – Vol.20(4). – P.285–291.
9. Izbicki T., Izbicka E., Mazur J. Prognostic significance of biochemical heterogeneity of catecholaminergic clones in neuroblastoma // J. Pediatr. Surg. – 2006. – Vol.41(9). – P.1506–1512.
10. Sukhareva G.V., Khomeriki S.G. Carcinoid and carcinoid syndrome // Eksp. Klin. Gastroenterol. – 2008. – Vol.3. – P.110–119.
11. Korse C.M., Bonfrer J.M,. Aaronson N.K. et al. Chromogranin A as an alternative to 5-hydroxyindoleacetic acid in the evaluation of symptoms during treatment of patients with neuroendocrine tumors // Neuroendocrinology. – 2009. – Vol.89(3). – P.296–301
12. Шайхелисламова М.В. Возрастно-половые особенности и механизмы адаптационных реакций у детей // Диссертации на соискание ученой степени д.б.н. – Казань. – 2007. – C.41.
13. Kwang S. R., Jong S. Y. The simultaneous determination of HVA, VMA and 5-HIAA by GC/MS // Seoul Clinical Laboratory. – 1996. – Vol.1. – P.1121–1125.
14. Glroni A., Seghieri G., Niccolai M, Mammini P. Simultaneous Liquid-Chromatographic Determination of Urinary Vanillylmandelic Acid, Homovanillic Acid, and 5-Hydroxyindoleacetic Acid // Clin. Chem. – 1988. – Vol.34/12. – P.2504–2506.
Резюме. В настоящей статье представлен новый высокотехнологичный метод определения метаболитов катехоламинов и серотонина в моче и плазме крови. Рассмотрены эффекты данных веществ и значение их основных метаболитов в норме и при различных патологических состояниях, показана эффективность применения данной методики в лабораторной диагностике ряда заболеваний.
Статья предназначена для врачей-педиатров, эндокринологов, наркологов и психиатров, специалистов клинической лабораторной диагностики.
Ключевые слова: метаболиты катехоламинов, серотонин, диагностика.
Новый метод хроматографического анализа метаболитов катехоламинов и серотонина в лабораторной диагностике различных заболеваний. 1Ю.А. Смолина, 1И.В. Золкина, 2П.Б. Глаговский, 1И.С. Мамедов, 1В.С. Сухоруков. 1НИЛ общей патологии ФГУ «МНИИ педиатрии и детской хирургии»,2кафедра клинической лабораторной диагностики ФУВ РГМУ.
Summary: In the present review a new high-tech method for determining metabolites of catecholamines and serotonin in urine and serum is set out. The effects of these substances and the value of their main metabolites in normal and various pathological conditions are considered, the efficiency of application of this technique in the laboratory diagnostic of several diseases are shown.
Article is intended for pediatricians, endocrinologists, narcologists and psychiatrists, specialists of clinical laboratory diagnostics.
Keywords: metabolites of catecholamines, serotonin, diagnostics.
| Показатель | Значение, нмоль/сут | Значение, мкг/сут |
| Норадреналин | До 570 | До 97 |
| Адреналин | До 150 | До 27 |
| Дофамин | До 3240 | До 500 |
| ВМК (VMA) | До 33,0 | До 6,6 |
| ГВК (HVA) | До 38,0 | До 6,9 |
| 5–ОИУК (5–HIAA) | 10,5 – 47,1 | 2,0 – 9,0 |
| Показатель | Значение, пмоль/л | Значение, нг/л |
| Норадреналин | До 2490 | До 420 |
| Адреналин | До 459 | До 84 |
| Дофамин | До 560 | До 85 |
Рис.1. Образец типичной картины данных, полученных в результате анализа методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием. ГВК(VMA) – гомованилиновая кислота, ВМК (HVA) – ванилинминдалевая кислота, 5-ОИУК (5-HIAA) – 5-гидроксииндолуксусная кислота.
Рис.2. Результаты, полученные методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, после обработки встроенной программой.
ГВК(VMA) – гомованилиновая кислота, ВМК (HVA) – ванилинминдалевая кислота, 5-ОИУК (5-HIAA) – 5-гидроксииндолуксусная кислота.
Таблица 1. Референсные значения катехоламинов, серотонина и их основных метаболитов, полученные на основании анализа мочи методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.
Таблица 2. Референсные значения катехоламинов, полученные на основании анализа плазмы крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием.
