Новые статьи
Омега-3 в эритроцитах
Омега-3 жирные кислоты в биопсии сердца, взятой у пациентов с пересаженным сердцем.Корреляция с эритроцитами и отклик на введение.
William S. Harris, PhD; Scott A. Sands, PhD; Sheryl L. Windsor, MT; Hakim A. Ali, MD; Tracy L. Stevens, MD; Anthony Magalski, MD; Charles B. Porter, MD; A. Michael Borkon, MD
Базовая проблематика. Показано, что омега-3 жирные кислоты (ЖК) снижают риск внезапной смерти от инфаркта миокарда. Считается, что это снижение происходит за счет включения эйкозапентаеновой кислоты (EPA) и докозагексаеновой (DHA) кислоты непосредственно в сердечную мышцу, изменяющего динамику функции натриевых и кальциевых каналов. У людей степень включения еще не была определена.
Методы и результаты. Впервые была определена корреляция между красными кровяными тельцами (ККТ) и уровнем омега-3 ЖК в сердечной мышце у 20 реципиентов сердечных трансплантатов. Изучено влияние введения омега-3 ЖК (1г/день) в течении 6 месяцев на состав ЖК в тканях сердца и внутриротовой полости, ККТ и липидов плазмы у 25 пациентов. Уровень EPA + DHAв красных кровяных тельцах и сердце высоко коррелировал (r=0.82, P<0.001). Дополнительное введение поднимает уровень EPA+DHAв ткани сердца на 110%, в ККТ – на 101%, в плазме – на 139%, и на 73% - в клетках щеки (P<0.005 по сравнению с общим исходным уровнем; ответы тканей различаются незначительно).
Выводы. Несмотря на то, что любая из исследованных тканей может являться индикатором содержания омега-3 ЖК в сердечной мышце, уровень EPA+DHAв ККТ высоко коррелирует с их уровнем в сердце; ответ ККТ на введение EPA+DHAбыл идентичен ответу сердца; ККТ легко отбирать и анализировать; они имеют менее сложный состав ЖК по сравнению с плазмой. Таким образом, уровень EPA+DHAв ККТ (также называемый индексом омега-3) может быть выбран индикатором сердечного омега-3 статуса.
Связь между уровнем омега-3 ЖК и смертностью от ишемической болезни сердца впервые наблюдали у Инуитов (племя эскимосов)в Гренландии. Более высокий по сравнению с датчанами уровень EPA+DHAв плазме Инуитов был обратно пропорционален количеству случаев острого инфаркта миокарда (ОИМ) в популяции. Накапливались экспериментальные и клинические данные, в дальнейшем подтвердившие кардиопротекторный эффект омега-3 жирных кислот. Более высокие уровни EPAи DHAбыли ассоциированы с уменьшением риска первичной остановки сердца, внезапной необратимой остановки сердца и неизлечимой ишемической болезни сердца. Общая смертность была снижена у пациентов с ОИМ, которым советовали употреблять жирную рыбу или дополнительно вводились омега-3 жирные кислоты. Последнее также снижало риск внезапной остановки сердца на 45%. Американская сердечная ассоциация недавно рекомендовала пациентам с ОИМ потреблять 1г/день EPAи DHA.
Ранние попытки изучения механизма, посредством которого омега-3 ЖК уменьшают риск смерти от ОИМ, были сфокусированы на их влиянии на классические факторы риска ОИМ, однако снижение уровня липидов сыворотки крови и кровяного давления не объясняют наблюдаемого снижения риска в случае внезапной остановки сердца. Возможное влияние EPAи DHA в количествах, меньших одного грамма, на агрегацию тромбоцитов, эндотелиальную функцию, вариабельность частоты сердечных сокращений и воспалительные маркеры остается не выясненным. Первые экспериментальные исследования инфарктов миокарда и последующее изучение МакЛеннаном и другими авторами у крыс и обезьян дало основание предполагать, что омега-3 жирные кислоты имели прямое защитное влияние непосредственно на сердце. У собак с моделированной желудочковой тахиаритмией введение омега-3 жирных кислот снизило число потенциально смертельных аритмий. Исследование изолированных мышечных клеток сердца выявило, что EPAи DHAмогут продлять рефракторное состояние этих клеток за счет взаимодействия с быстродействующими натриевыми каналами и кальциевыми каналами L-типа. Считается, что этот противоаритмический эффект происходит вследствие высвобождения EPAи DHAиз мембранных фосфолипидов сердечной мышцы фосфорилазой А2, активируемой при ишемии, и последующим взаимодействием свободных кислот с ионными каналами. Было показано, что употребление в пищу омега-3 жирных кислот увеличивает содержание EPAи DHA, включенных в ткань сердца у подопытных животных, но неизвестна степень, с которой введение этих жирных кислот, способных уменьшать риск внезапной остановки сердца, влияет на состав ЖК сердечной мышцы человека.
Настоящее исследование имело 2 цели. Первой было определение уровня EPAи DHAв тканях сердца человека в нормальных условиях и в условиях введения дополнительных кислот. Второй целью работы было установить, могут ли какие-либо легкодоступные ткани (плазма, ткань щеки, или красные кровяные тельца) быть маркером уровня EPAи DHAв тканях сердца.
Методы.
Протоколы. Отчет описывает результаты двух раздельных, но взаимосвязанных экспериментов по изучению стабильных реципиентов трансплантированного сердца. В промежуточном исследовании мы изучали корреляцию между содержанием EPA+DHAв ткани сердца и ККТ, а также корреляцию их содержания в тканях с потреблением омега-3 ЖК. Для этого исследования были приглашены все пациенты, которые должны были подвергаться регулярной биопсии сердца в течение двух месяцев, вне зависимости от количества омега-3 ЖК в их диете. Пациентов просили позволить брать на 1 грамм больше образца ткани для анализа ЖК, а также расспрашивали об общем количестве рыбы и количестве жирной рыбы, которую они потребляют. Пациентов, принимающих добавки рыбьего жира или употребляющих в пищу рекомендованное количество рыбы (не менее двух рыбных блюд в неделю) рассматривались как потребители большого количества омега-3 жирных кислот; те пациенты, которые не получали дополнительного введения омега-3 ЖК и потребляющие менее двух рыбных блюд в неделю классифицировались как потребители малого количества.
Во втором исследовании определяли влияние введения омега-3 ЖК в течение 6 месяцев на уровни EPAи DHAв четырех тканях человека: сердце, ККТ, плазме и клетках щеки. От пациентов требовалось соблюдение следующих критериев: срок после трансплантации должен был быть не менее 3 месяцев, не употреблять дополнительно рыбий жир в течение 6 месяцев, иметь уровень сывороточного креатинина не более 2,0 мг/мл; употреблять постоянные дозы медицинских препаратов, включающих стероиды и иммунносупрессорные препараты; проходить биопсию сердца как минимум 2 раза в год. Пациентов просили употреблять 2 капсулы добавок в день (30/20 TG Рыбий жир, OceanNutritionCanada, Ltd), содержащих 500 мг EPA+DHAв капсуле (30% EPAи 20% DHA) в виде триглицеридов.
Согласие информированных пациентов было получено заранее. Оба исследования были одобрены международным советом госпиталя Св. Люка.
Лабораторные методы.
Методика сбора тканей.
Биоптаты сердца были получены в ходе катетеризации правого желудочка сердца через яремную внутреннюю вену. Ткань была получена из межжелудочковой диафрагмы, немедленно погружалась в солевой раствор и замораживалась при ‑70С.
Клетки щеки получали соскобом с внутренне стороны щек после трехкратного промывания дистиллированной водой. Образец недолго центрифугировали, сливали супернатант и замораживали клетки при -70С
ККТ и плазму получали сбором крови натощак в раствор ЭДТА. Клетки осаждали центрифугированием, плазму отделяли и замораживали. Светлый слой кровяного сгустка (лейкоцитную пленку) отбрасывали. Собранные ККТ хранили при -70С (в предыдущих экспериментах было показано, что промывание эритроцитов необязательно, поскольку оно не влияет на состав ЖК).
Материалы. Изопропанол, метанол, метилен хлорид, гексан, 14% раствор BF3 в метаноле, бутилированный гидрокситолуол и L-α-фосфатидилхолина дигептадеканоат Sigma-Aldrich (использовали в качестве внутреннего стандарта). Бутилированный гидрокситолуол добавляли ко всем органическим растворителям в концентрации 50 мг/л.
Пробоподготовка тканей/экстракция липидов.
Ткани сердца и щеки сначала лиофилизировали (прибор SavantSpeed-VacPlus) в течение ночи. Биоптаты сердца затем измельчали перетиранием между двумя стеклами. После лиофилизации, все образцы ресуспендировали в солевом растворе, подвергали сонификации от 10 до 15 секунд (4710 UltrasonicHomogenizer, Cole-Parmer). Затем липиды экстрагировали метанолом (содержащим внутренний стандарт) и метиленхлоридом, как описано в [18]. Растворитель затем испаряли в атмосфере азота.
Размороженные ККТ экстрагировали изопропанолом (содержащим внутренний стандарт) и метиленхлоридом (1:30:14,4). После центрифугирования, растворитель испаряли в атмосфере азота.
Липиды плазмы экстрагировали метанолом, солевым раствором и метиленхлоридом (1:25:75:50). После центрифигурования водный слой не использовали, а органический слой переливали и испаряли растворитель в атмосфере азота.
Липиды, экстрагированные из образцов сердца, щеки и ККТ метилировали BF3 при 100 °С в течение 10 минут. В этих условиях происходит трансметилирование глицерофосфолипидов, но не сфинголипидных ЖК. Образцы липидов плазмы нагревали с BF3, метанолом и бензолом при 100 °С в течение 45 минут – в условиях, в которых происходит трансметилирование всех ЖК. После охлаждения, все образцы экстрагировали гексаном и водой (1:2:2). Гексановый слой отбирали и испаряли азотом, растворённый гексаном сухой остаток, содержащий метиловые эфиры ЖК подвергали анализу на газовом хроматографе с пламенной ионизацией, как описано ранее в работе [20]. Содержание ЖК идентифицировали по стандартам, а состав ЖК рассчитывался как массовый процент от всех ЖК. Коэффициент вариации анализа EPA+DHAв ККТ составил от 10 до 12%, для общего содержания EDA+DHA в плазме – от 13 до 17%.
Липиды и липопротеины плазмы.
Сыворотка, собранная натощак у всех 25 пациентов во втором исследовании, была проанализирована до и после введение ЖК на общий холестерин, триглицериды и HDL-холестерин (LDL-C) на CobasFaraII (Roche) с ферментативными реагентами. HDL-C в сывороточном супернатанте определяли после осаждения VLDLи LDL, как описано в [21]. LDL-Cопределяли по уравнению Фридвольда.
Статистический анализ.
Для расчета коэффициентов корреляции между тканями по методу Пирсона использовали MSExcel 97 DataAnalysisPackage. Для проверки гипотезы о том, что 2 коэффициента корреляции различались существенно, каждый сначала переводили в z-счет, а затем возможное значение рассчитывали из таблицы нормальных z-параметров. Парные t-тесты использовали для сравнения базовых линий и конечных значений во втором исследовании, и непарные t-тесты использовали для сравнения этих же параметров в промежуточном (первом) исследовании между выборками с высоким и низким содержанием омега-3 ЖК. Погрешность рассчитана для доверительной вероятности P<0.05. Если не оговорено дополнительно, результаты представлены в виде ЗНАЧЕНИЕ±SEM.
Результаты.
Промежуточное исследование.
Образцы сердца и ККТ были получены от 20 случайных пациентов после трансплантации сердца. Средний возраст группы составил 45±14 лет; мужчин было 15. Среднее время после трансплантации составило 1,8 года (от 0,3 до 9,7 лет). Наблюдалось крайне высокая корреляция между уровнями омега-3 ЖК в тканях сердца и ККТ (рис.1) для всех пациентов (r=0.82, P<0.001). из 20 пациентов, 13 рассматривались как потребители высокого количества омега-3 ЖК, а 7 – низкого. Хотя коэффициенты корреляции для каждой из групп были одинаковы (r=0.84, P<0.001), взаимоотношения между двумя тканями в пределах каждой из групп различались. Наклон линии регрессии для группы с низким потреблением был круче, чем для группы с высоким (рис.1). Общий уровень EPA+DHAкак процент от общего содержания ЖК в ККТ был 7,0±0,70% в последней группе, тогда как в первой – 3,3±0,15% (Р=0,002). Для ткани сердца эти значения составили 2,5±0,27% и 1,5±0,14% соответственно (Р=0,003).
Изучение дополнительного введения ЖК.
В этом исследовании принимало участие 25 человек, для 21 были доступны образцы всех 4х видов тканей. Средний возраст группы 55±9 лет; было 16 мужчин. Среднее время после трансплантации – 5,2 года (от 0,5 до 12,5 лет). Во всех 4х тканях статистически достоверное увеличение уровня EPA+DHAдостигалось спустя 6 месяцев употребления рыбьего жира. Среднее увеличение содержания EPA+DHAв тканях сердца составило 110%, в то время как в ККТ, щеке и плазме – 101. 73 и 139% соответственно (Рис.2). Между этими реакциями не было статистически значимой разницы. Значение увеличения содержания EPAи DHAпо отдельности было сходным во всех 4 тканях, хотя увеличение уровня первой из них было значительно больше, чем последней. В ткани сердца уровень EPAувеличился на 272±44%, а DHA – на 94±27%; в щеке на 124±36% и 95±48%; в плазме – па 365±52% и 104±16%: в ККТ - 279±33% и 84±9% соответственно.
В целом, корреляция между тканью сердца и тремя ее возможными аналогами была следующая: ККТ, r=0.47 и Р=0,031; щека, r=0,49 и Р=0,023; плазма, r=0,22 и Р=NS. Для ККТ (единственная ткань, которая использовалась в обоих исследованиях) корреляция (Р=0,06) во втором исследовании имеет тенденцию быть ниже (r=0,47) чем в первом (r=0,82).
У 25 объектов второго исследования не было замечено значительного влияния введения 1 г/д омега-3 ЖК на липиды и липопротеины сыворотки: общий холестерин, 179±9 против 179±8 мг/дл; триглицериды 232±42 против 197±30 мг/дл; HDL-С 47±4 против 46±4 мг/дл; и LDL-C 87±6 против 91±6 мг/дл.
Обсуждение результатов.
Исходя из существующих доказательств, предполагается, что кардиопротекторный механизм омега-3 ЖК зависит от их присутствия в мембранах клеток сердечной мышцы. Таким образом, знание уровня омега-3 ЖК может иметь клиническое значение. Поскольку измерить его непросто, требуется аналогичная ткань, которая будет отражать уровень омега-3 ЖК в сердце и при этом ее будет легко отбирать.
Суррогаты для определения содержания омега-3 ЖК в сердечной мышце.
В качестве возможных суррогатов исследовали 3 различных ткани: ККТ, плазму и клетки щеки. Чтобы определить, какие из этих трех тканей могут служить наилучшим суррогатом сердца, принимали во внимание базовую корреляцию ткани сердечной мышцы и ККТ (исследование 1) и ответ всех 4х тканей на дополнительное введение омега-3 ЖК (исследование 2), как практическое, так и аналитическое исследование.
Клетки щеки.
Клетки щеки были использованы для неинвазивной оценки уровня омега-3 ЖК у детей и взрослых. У грудных младенцев EPA+DHAсоставляет 1,1% от общего содержания фосфолипидных ЖК в клетках щеки, у взрослых – 0,9%. В сравнении в этими значениями, полученное нами значение 1,6% после введения дополнительных омега-3 ЖК является благоприятным (табл.)
В процентном соотношении, ответ клеток щеки не был статистически отличим от ответа других тканей; однако, в целом, он был ниже, чем в сердце (73% против 110%). С практической точки зрения, получение клеток щеки – более длительный и сложный процесс в сравнении с отбором крови. Этот процесс требует воздержания от еды, чистки зубов и использования губной помады или бальзама для губ утром перед тестом. Также он включает двукратный соскоб с внутренней стороны щеки в течении 30 секунд с последующим промыванием. Кроме того, путем соскоба щеки получается гораздо меньше образца, чем при взятии крови, что также затрудняет анализ.
Плазма.
В процентном отношении, отклик плазмы не был статистически отличим от отклика других тканей; однако, в целом, он был выше, чем в сердце (139% против 110%). ЖК плазмы входят в несколько различных липидных классов: эфиры холестерина, триглицеролы, фосфолипиды и неэстерифицированные жирные кислоты. Вследствие того, что каждый из этих классов, имеет уникальную композицию ЖК, изменение уровня содержания специфического класса в плазме (например, триглицеролов) может изменить общий состав ЖК плазмы независимо от их поступления.
Коэффициент вариации уровня содержания EPA+DHAдля базовой линии составил 23% для ККТ и 39% для плазмы (табл.), отражая более высокие межиндивидуальные изменения содержания EPA+DHA в последнем по сравнению с бывшими. ЖК, превращённые в эфиры в сердечной мышце, находятся фактически в фосфолипидах, поэтому не удивительно то, что ЖК фосфолипидов плазмы лучше отражают состав ЖК тканей, чем вся плазма. Таким образом, если бы была доступна только плазма (в качестве клинической пробы), то измерение состава ЖК во фракции фосфолипидов было бы предпочтительнее его измерения в плазме крови.
Эритроциты.
Существует высокая корреляция (r=0.82) между содержанием EPA+DHA в ККТ и сердечной мышце при поперечном разрезе, более низкая корреляция была найдена на стадии введения (r=0,47). Это различие объясняется рядом возможных причин. Во-первых, стадия введения включает в себя этапы отбора добавок омега-3 ЖК, а при поперечном разрезе нет, при этом наблюдалось большое расхождение в значениях содержания EPA+DHA полученных (5-fold в ККТ, 10-foldв сердце), по сравнению с изначальными (2,6-fold, 7-foldсоответственно). Это делает корреляцию более заметной. С другой стороны, при низких введениях, содержание в тканях может варьироваться.
Ко всему прочему, незначительно процентное увеличение содержания EPA+DHAпри введении в ККТ (101%), более значительно влияние на сердечную мышцу (110%), что сказывается на их содержании в плазме или клетках щеки. ККТ могут быть более предпочтительными по сравнению с плазмой, поскольку содержание EPA+DHA в исходном материале не чувствительно к последнему приёму пищи. Мы обнаружили, что содержание EPA+DHA в ККТ не изменялось в крови, отобранной после обеда, у 10 здоровых добровольцев (-5%; P=NS), тогда как содержание этих кислот в плазме уменьшилось на -24% (P=0,006; неопубликованные наблюдения). Таким образом содержание EPA+DHA в ККТ, также называемое Омега-3 Индексом, может быть сопоставлен с HbA1Cи отражать в среднем влияние на ткани омега-3 ЖК. Эти и другие факторы позволяют предположить, что содержание EPA+DHA в ККТ может быть наиболее подходящим индикатором для определения содержания омега-3 ЖК в сердечной мышце.
Известно, как быстро омега-3 ЖК включаются в различные ткани. Однако, даже если клетки сердечной мышцы культивируют только 3-5 дней, включения EPA+DHAв мембраны достаточно для заметного изменения электрофизиологических свойств, поэтому вполне вероятно, что введение омега-3 ЖК в относительно короткие сроки может обогатить ими сердечную мышцу. Наблюдается быстрое сокращение сердечных случаев при применении дополнительного введения, в своей работе Gissi поддерживает эту гипотезу.
Эффект отклика показанный на ушной сере и липопротеиновых концентратах.
Введение примерно 1 г EPA+DHA практически не влияет на уровень этих кислот в липидах серы или липопротеинах, что поддверждается многими проведёнными стадиями. Наиболее показательно, в работе Gissi, 850 мг EPA+DHA не оказывают влияния на общий или липопротеиновый холестерина уровни содержания, понижая только содержание триглицеридов на 6%, но значительно повышая при этом случаи ОИМ. Понижение триглицеридов в исследовании составила 15% (P=0,07)
Заключение.
Содержание EPA+DHA в ККТ высоко коррелирует и отвечает на введение омега-3 подобно уровню содержания омега-3 ЖК в ткани сердца. ККТ легко выделяются из крови, взятой у пациентов натощак и после еды, и подвергается анализу, дополнительное введение отражается на содержании EPA+DHAчерез несколько недель. Мы сделали вывод, что Омега-3 индекс может использоваться как индикатор содержания омега-3 ЖК в сердечной мышце.
